據(jù)美國(guó)約翰斯·霍普金斯大學(xué)4月2日發(fā)布的最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球新冠肺炎累計(jì)確診病例超過(guò)100萬(wàn)例，死亡逾5.1萬(wàn)例。截至4月1號(hào)，美國(guó)確診超過(guò)23萬(wàn)例；英國(guó)、西班牙、法國(guó)出現(xiàn)單日最大死亡增幅；韓國(guó)“高考”延遲兩周；世衛(wèi)組織稱(chēng)，亞太疫情或迎“持久戰(zhàn)”。引起新冠肺炎的病原體是一種新型冠狀病毒，與此前大家熟悉的嚴(yán)重急性呼吸道綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）和中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）具有較近的親緣關(guān)系，被感染的患者會(huì)以發(fā)熱、乏力、干咳為主要臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重者快速進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征，甚至死亡。研究表明部分抗艾滋病病毒HIV藥物對(duì)冠狀病毒有一定的抑制作用，但是目前為止尚無(wú)特效藥和疫苗批準(zhǔn)上市，針對(duì)新型冠狀病毒的藥物靶點(diǎn)研究以及新藥的研發(fā)迫在眉睫。
在這次疫情防控和科研攻關(guān)當(dāng)中，高等學(xué)校及其附屬醫(yī)院是一支非常重要的力量。近期，輕工科學(xué)與工程學(xué)院郭俊凌教授課題組與哈佛醫(yī)學(xué)院研究團(tuán)隊(duì)在國(guó)際頂級(jí)期刊《Angewandte Chemie International Edition》（德國(guó)應(yīng)用化學(xué)）以外封面形式在線發(fā)表題為“Unidirectional Presentation of Membrane Proteins in Nanoparticle-Supported Liposomes”研究論文（2019年6月25日正式發(fā)表）。該研究開(kāi)發(fā)一種病毒膜蛋白新型組裝技術(shù)以及一種人工病毒合成的新平臺(tái)方法，同時(shí)該技術(shù)也可以用來(lái)研發(fā)各種受體蛋白、離子通道以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的高效抗體。在該研究中，研究人員成功地合成了艾滋病HIV類(lèi)病毒，并且檢驗(yàn)了其在動(dòng)物模型中有效抗體的產(chǎn)生，這個(gè)研究極大地鼓舞了該研究團(tuán)隊(duì)嘗試?yán)眠@項(xiàng)新技術(shù)合成新型冠狀病毒SARS-CoV-2疫苗。
抗體藥物或疫苗研發(fā)，大部分都是以生物膜蛋白以及膜錨定蛋白為靶點(diǎn)，如何把這些生物膜蛋白質(zhì)呈遞給免疫系統(tǒng)是當(dāng)前的核心難點(diǎn)。目前主要有三種方法呈遞膜蛋白：1、將膜蛋白放入脂質(zhì)體中，但脂質(zhì)體本身并不穩(wěn)定，容易和細(xì)胞內(nèi)的囊泡相融合，且膜蛋白質(zhì)重組到脂質(zhì)體的過(guò)程中朝向完全是隨機(jī)的；2、納米碟被廣泛用作膜蛋白的載體，并且非常穩(wěn)定，但納米碟尺寸較小（15納米以?xún)?nèi)），一個(gè)納米碟只攜帶1-2個(gè)膜蛋白，對(duì)于免疫系統(tǒng)的刺激作用很弱；3、利用類(lèi)病毒顆粒來(lái)呈遞，類(lèi)病毒顆粒的制作程序?qū)τ诿總€(gè)膜蛋白都不一樣，每個(gè)系統(tǒng)都要花費(fèi)很多的時(shí)間和材料來(lái)優(yōu)化，而且很多過(guò)程難以人為控制。
為解決復(fù)雜膜蛋白的呈遞問(wèn)題，我院青年專(zhuān)家郭俊凌特聘教授與國(guó)際著名結(jié)構(gòu)生物學(xué)家、美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院James Chou教授共同研發(fā)，以植物多酚修飾的納米顆粒為內(nèi)核，通過(guò)多酚基團(tuán)和膜蛋白的特異結(jié)核作用，將膜蛋白脂質(zhì)體包裹在納米顆粒表面，從而構(gòu)建了無(wú)傳染新的人工蛋白。此方法被命名為SPLANDID平臺(tái)（Supported Proteoliposome for Antigen Directed Display），該平臺(tái)的具體流程如圖一所示：1a. 將納米顆粒表面修飾為植物多酚（包含鄰苯二酚或鄰苯三酚）；1b. 純化后的病毒膜蛋白質(zhì)被重組在脂碟（bicelle）；1c. 通過(guò)納米顆粒表面的鄰苯二酚或鄰苯三酚基團(tuán)，可以與膜蛋白上的親和標(biāo)簽特異性的結(jié)合（包括Ni-NTA分子和組氨酸標(biāo)簽的結(jié)合）; 1d. 膜蛋白質(zhì)攜帶脂碟被有序的吸引到納米顆粒的表面，通過(guò)透析作用或者其他方法逐漸的將表面活性劑去掉，脂分子會(huì)相互融合，進(jìn)而形成封閉的包含有病毒膜蛋白質(zhì)的脂質(zhì)體。
這樣組裝的脂質(zhì)體攜帶有序單一朝向的、高拷貝數(shù)且具有活性的病毒膜蛋白質(zhì)，成功的將艾滋病病毒HIV的跨膜蛋白和膜外臨近區(qū)（HIV-1 MPER-TMD）重組在加固的脂質(zhì)體表面并進(jìn)行了免疫實(shí)驗(yàn)，對(duì)有效激活免疫系統(tǒng)具有重要生物學(xué)意義。
圖1.SPLANDID人工病毒合成平臺(tái)具體流程
在該研究中，研究團(tuán)隊(duì)首先制備了植物多酚修飾的金納米顆粒，將NTA分子與鄰苯二酚或鄰苯三酚上產(chǎn)生親電反應(yīng)，并加入鎳離子，從而在金納米顆粒表面形成Ni-NTA配合物（圖二a）；修飾后的納米顆粒和組氨酸標(biāo)簽的親和作用通過(guò)核磁共振譜進(jìn)一步驗(yàn)證（圖二b）。將重組在脂碟中的HIV-1 MPER-TMD和修飾后的金多酚納米顆粒以最佳比例混合，并通過(guò)透析去掉系統(tǒng)中的表面活性劑，最終得到了由膜蛋白和納米顆粒誘導(dǎo)形成的大小均一的膜蛋白脂質(zhì)體（圖二d，e）。在HIV-1 MPER-TMD的N端和C端分別有抗Flag標(biāo)簽和組氨酸標(biāo)簽，最終制備的HIV-1 MPER-TMD脂質(zhì)體只能被抗組氨酸標(biāo)簽的抗體識(shí)別，而不能被抗Flag的抗體識(shí)別（圖二g），說(shuō)明了HIV-1 MPER-TMD在脂質(zhì)體的朝向是單一的，能被精確控制的。同時(shí)，該研究也測(cè)試了利用DNA折紙法形成的空心球作為內(nèi)核也同樣能指引HIV-1 MPER-TMD脂質(zhì)體的組裝（圖二f）。
圖2.構(gòu)建了具有艾滋病病毒HIV典型結(jié)構(gòu)的生物納米結(jié)構(gòu)
研究團(tuán)隊(duì)將組裝好的MPER-TMD脂質(zhì)體注射到豚鼠的體內(nèi)，并在每次注射后的4個(gè)星期收集豚鼠的血清（免疫實(shí)驗(yàn)仍在進(jìn)行中）。通過(guò)ELISA反應(yīng)的檢測(cè)，血清里含有大量可以和MPER-TMD蛋白特異性結(jié)合的抗體，并且抗體的含量隨著免疫實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行而增加（圖三）。MPER-TMD蛋白由于大部分區(qū)域都在生物膜內(nèi)，具有非常弱的免疫原性，到目前為止還沒(méi)有通過(guò)免疫M(jìn)PER-TMD蛋白而誘導(dǎo)產(chǎn)生中和性抗體的記錄。但是，通過(guò)SPLANDID方法制備的MPER-TMD脂質(zhì)體，可以在很短的時(shí)間內(nèi)就能通過(guò)免疫反應(yīng)在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的大量的抗體，能夠高效的刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生HIV特異性抗體。該部分結(jié)果為獲得艾滋病病毒、新型冠狀病毒SARS-CoV-2、中東呼吸綜合征冠狀病毒MERS-CoV的中和性抗體建立了研究基礎(chǔ)。
圖3.由植物多酚修飾的納米顆粒支撐的艾滋病病毒MPER-TMD膜蛋白脂質(zhì)體的免疫原性
此研究由郭俊凌教授課題組、美國(guó)哈佛醫(yī)學(xué)院James Chou教授團(tuán)隊(duì)合作完成，哈佛醫(yī)學(xué)院陳文博士為第一作者，四川大學(xué)與哈佛大學(xué)為共同通訊單位，該研究由國(guó)家高層次人才項(xiàng)目、四川大學(xué)“雙百人才工程”引進(jìn)計(jì)劃、四川大學(xué)“雙一流”建設(shè)計(jì)劃、美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所基金資助完成。該研究部分工作在四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院生物質(zhì)先進(jìn)材料與納米界面研究中心完成（https://www.bmicenter.org/）。
